单细胞+外泌体|解析人肝内胆管癌的细胞间通讯
分享是一种态度
文章标题：Single-cell transcriptomic architecture and intercellular crosstalk of human intrahepatic cholangiocarcinoma
期刊：Journal of Hepatology(IF=20.582)
日期：2020 Nov
DOI(url): doi.org/10.1016/j.jhep.2020.05.039
作者及单位：北京工业大学环境与生命学部阎新龙教授团队、解放军总医院第五医学中心刘兵研究员团队、军事科学院军事医学研究院裴雪涛研究员团队和岳文研究员团队
文献概述
单细胞转录组数据集是分析人肝内胆管癌细胞多样性和细胞间crosstalk的宝贵资源 恶性细胞表现出明显的肿瘤间异质性，Tregs表现出高度的免疫抑制特征 六个不同的成纤维细胞亚群在ICC和邻近组织中被定义 CD146+ vCAFs是成纤维细胞的主要组成部分，通过IL-6/IL-6R轴与恶性细胞紧密相互作用 肿瘤外泌体miR-9-5p诱导vCAFs中IL-6表达，通过上调EZH2促进ICC进展
数据和方法
由北京博奥和北京贝瑞公司提供测序 single-cell 3' v2 or v3 (10x Genomics)
GSE138709：4 ICC, 1 recurrent, 3 adjacent tissues GSE142784 GSE148773
Note：如果不想看前面的各种亚群细分以及各自的markers特征，可以跳到最后看外泌体是如何参与肿瘤细胞与其他细胞之间的通讯的
主要结果
一、主要分群10大类（各种markers）
使用4 treatment-naïve ICC samples, 1 recurrent ICC sample, and 3 adjacent tissues共8个样本：5个癌样本和3个临近的正常组织样本，10X测序， 共43,721个细胞（GSE138709）。经过严格的过滤，剩下31,302个细胞。
过滤标准，去瞄一眼
去掉细胞：cells < 2001 (UMIs), > 6,000 or < 501 genes, or > 20% 线粒体基因 cells had an average expression level of less than 2 for a curated list of housekeeping genes significant PCs (top 10) were selected to perform dimension reduction FindClusters function (dims.use = 1:10, resolution = 0.3)
主要分成了10个cluster
malignant cells：(11,601 cells, 37.1%, marked with EPCAM, keratin 19 [KRT19],and KRT7); 胆管细胞 cholangiocytes：(546 cells, 1.7%, marked with FYXD2,TM4SF4, and ANXA4); 肝细胞hepatocytes：(328 cells, 1.0%, marked with APOC3, FABP1, and APOA1); B cells：(827 cells, 2.6%, marked with MS4A1 and CD79A); T cells：(10,883 cells, 34.8%, marked with CD2, CD3D, and CD3E); natural killer (NK) cells：(1,597 cells, 5.1%,marked with CD7, FGFBP2, and KLRF1); macrophages：(3,407 cells,10.9%, marked with CD14); dendritic cells：(765 cells, 2.4%, marked with CLEC9A and CD1C); fibroblasts：(498 cells, 1.59%, marked with ACTA2 and COL1A2); and endothelial cells：(823 cells, 2.6%, marked with ENG and vWF
恶性细胞使用inferCNV鉴定
每个cluster类别的特征：其实你是可以可以看到肿瘤细胞中的基因表达数和UMI数是要比其他细胞类型多的，并且癌细胞存在高度的样本间异质性。
昨天看了个研究56个样本，测了20多万细胞，我看见他的过滤是：>3k 基因的细胞被搞掉了。。。
二、恶性细胞分析
对上皮细胞进行重新聚类分群，分为6个亚群，根据inferCNV可以判断出来。
癌细胞为0-3四个亚群。 Subclusters 4为(cholangiocytes，胆管细胞，高表达FXYD2 and RHOB基因。 第五群为hepatocytes，肝细胞，高表达ASGR1 and APOE
四个癌细胞亚群展示出不同的生物学特征：
subcluster 0：EMT-dominant signature subcluster 1：hypoxia-dominant signature subcluster 2：interferon response-dominant signature subcluster 3：来源于复发样本，高表达SPINK1
作者还进行了转录因子调控分析，发现SNAI2, MYC, and STAT1是三个潜在的差异转录因子。这么多转录因子，为何只挑了这三个进行说明？？？
每个转录因子和其target的打分映射。
三、treg在ICC肿瘤中富集
首先是T和NK细胞的分类：分了8类
C0–CD8T–GZMK (CD8A+ GZMK+,subcluster 0) C1–CD8T–GZMB (CD8A+ GZMB+ , subcluster 1) C2–CD4T–naïve (CD4+ IL7R+ , subcluster 2) C3–CD8T–naïve (CD8A+ IL7R+ , subcluster 3) C4–NK–GZMH and C5–NK–GZMK (KLRF1+ , subcluster 4, 5) C6–CD8T–proliferation (CD8A+ TOP2A+ MKI67+ , subcluster 6), and C7–Tregs–FOXP3 (CD4+ FOXP3+ , subcluster 7
恶性细胞与淋巴系的细胞进行配受体分析发现：the TIGIT-PVR 配受体对 显著富集在 Tregs和malignant cells之间。
四、纤维母细胞亚群分析
ICC突出特点是促结缔组织增生反应，这里确定了6个不同的成纤维细胞亚群。
由于原始数据集合中只有498个纤维细胞，作者使用的dataset2，共 13,150个细胞，又经过严格筛选，剩下 2,941个细胞。
这个过滤是不是有点狠，然后分成了6群，每群都高表达纤维细胞经典marker：ACTA2 (a-SMA), COL1a2 and PDGFRb
C0：vascular CAFs (vCAFs, vCAFs-c0-MCAM) C1：matrix CAFs (mCAFs, mCAFs–c1–POSTN) C2：inflflammatory CAFs(iCAFs, iCAFs–c2–FBLN1) C3：antigen-presenting CAFs (apCAFs, apCAFs–c3–CD74) C4：EMT-like CAFs (eCAFs, eCAFs–c4–KRT19) C5：lipofifibroblast–c5–FABP1
其中大多数是CD146 (MCAM)阳性血管相关癌症成纤维细胞（vCAFs），免疫荧光染色发现CD146+ vCAF位于肿瘤中心与微血管区，细胞内L-R分析发现：纤维细胞表达更多的配体与癌细胞作用。
通过前面的分析和后续的各种实验验证了这个：IL-6/IL-6R在vCAFs细胞与ICC细胞之间的相互作用。并且vCAFs能够引起ICC细胞的进展。
那么，vCAF分泌IL6作用于癌细胞的IL6R，这个会引起癌细胞内哪些变化从而使其恶性程度增加呢？
因此，我们测了由vCAF处理前后的GFP-positive的ICC细胞，做差异分析，以及后续的(bulk 芯片数据，TCGA的bulk数据验证，发现vCAF分泌的IL-6在ICC细胞中诱导了明显的表观遗传学改变，特别是上调了DNA甲基转移酶EZH2，从而增强了其恶性程度。
还有一个有意思的问题就是：那vCAFs高表达IL6这件事情是不是癌细胞搞的鬼呢？
五、ICC肿瘤细胞分泌的外泌体miR-9-5p被vCAF内化摄取，引起IL-6的高表达，从而促进肿瘤进展
因为肿瘤细胞分泌的外泌体可以指导基质促进肿瘤进展，使用由ICC细胞分泌的外泌体处理vCAFs时，vCAFs中的IL-6显著上调。
由于外泌体中的miRNA最为丰富，并且最近有研究发现miRNA可以参与肿瘤细胞与基质细胞之间的通话crosstalk。
因此我们假设：ICC细胞来源的外泌体可能包裹着mirna介导vCAFs中IL-6表达上调。
为了验证这个假设，作者对ICC细胞分泌的外泌体进行提纯，对其中的miRNA进行了qPCR分析。
我们发现外泌体中的miR-9-5p可以显著的增强vCALs中IL6的表达，而IL6可以引起EZH2的表达，从而促进ICC细胞的恶性程度。
总的来说，就是作者发现了一群细胞vCAFs与肿瘤细胞有频繁的配体-受体关联，然后通过外泌体的分析发现其中的具体机制：肿瘤细胞分泌的外泌体中包裹的丰富的miRNA运输到vCAF中调控其高表达IL-6有利于自己干坏事，在这里起到一个调控因子的作用。
最后，有个小问题：文中发现Tregs和malignant cells也有紧密的配受体关联，这个机制作者为什么没有挖下去呢？
如果你对单细胞转录组研究感兴趣，但又不知道如何入门，也许你可以关注一下下面的课程
看完记得顺手点个“在看”哦！
长按扫码可关注